一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法

1. 试剂配制

(1) 2N 氢氧化钠200mL ：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL 容量瓶中。

(2) 3，5-二硝基水杨酸溶液 1000mL ：称5g 二硝基水杨酸，溶于200mL2N 氢氧化

钠和500mL 蒸馏水中，再加300g 酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL (不超过7天)。

(3) 1/15M 磷酸氢二钠1000mL ：23.867g Na 2HPO 4·12H 2O 溶于1000mL 蒸馏水中。

(4) 1/15M 磷酸二氢钾 1000mL ：9.078g KH2PO 4溶于1000mL 蒸馏水中。

(5) pH5.5磷酸缓冲液100mL ：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL 磷酸二氢钾(1/15M)

(6) 8%蔗糖1000mL ：称取80g 蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL 。

(7) 甲苯。

(8) 标准葡萄糖溶液(1mg/mL)1000mL ： 取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g 葡萄糖溶于100ml 蒸馏水中成标准葡萄糖母液(10mg 还原糖/ml)。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL 即成标准葡萄糖液(1mg/ml);

2. 操作步骤

(1)标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液 0.4mL ，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL,3.2mL 于50 mL 比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL 。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min ，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL ，并在分光光度计上于波长508nm 处进行比色。

比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

(2)土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g 土样，置于50mL 三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h 。到时取出，6000rpm 离心10min 。取1.0mL 上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL ;风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL )于50mL 比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。

3.结果计算

蔗糖酶活性以24h 后1g 土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖(mg )=(a-b)×c

式中 a---从标准曲线查得的样品(加了基质)对应的葡萄糖浓度，mg/mL;

b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL;

c ---换算成1g 土的系数。