A 1 方法原理

样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解，用DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。

A 2 活性单位定义

在温度为50℃，pH 5.3条件下，1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量，为1个木聚糖酶的活性单位(BXU)。

A 3 应用范围

本法用于来源于曲霉属(Aspergilious)或木霉属(Trichoderma)的木聚糖酶样品的测定。当分析其它来源的酶时，该法的线性需要校正。本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。

A 4 测定条件

A 4.1 底物： 燕麦木聚糖

A 4.2 pH： 5.3

A 4.3 温度： 50℃±0.5℃

A 4.4 保温时间： 5min

A 5 仪 器

A 5.1 超级恒温水浴锅：50℃

A 5.2 水浴锅： 100℃

A 5.3 旋涡磁力搅拌器

A 5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度

A 5.5 分析天平：感量0.0001g

A 6 试 剂 所有试剂溶液均需用去离子水配制。

A 6.1 柠檬酸缓冲液(0.05mol/l、pH5.3)

溶解10.5g柠檬酸(C6H8O7•H2O)于800ml水中，并用1mol/L氢氧化钠调pH至5.3，(消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠)，再用水定容至1000ml。

A 6.2 底物—1%燕麦木聚糖

称取1.0g燕麦木聚糖，溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。用柠檬酸缓冲液定容至100ml。此底物溶液在4℃时最多保存一周，或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存，临用前融解，搅拌均匀使用。

A 6.3 DNS试剂

溶解50.0g 3，5二硝基水杨酸于4000ml水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0g氢氧化钠，使之完全溶解，在继续磁力搅拌下，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000ml。如溶液不澄清，用Wheatman1号滤纸过滤，然后室温保存于深色瓶中。

A 7 样品制备

精确称取样品1.0000g，置于研钵内，加入5ml的柠檬酸缓冲液，研磨片刻，放置30min后，用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。

A 8 测定步骤

A 8.1 试样测定

分别向2支试管加入1.8ml底物溶液，置50℃水浴保温5min。在其中1支试管中加入200μl稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置50℃水浴中，准确保温5min。分别加入3.0ml DNS试剂至2支试管中，搅拌均匀。在另一试管(空白管)中加入200μl缓冲液。同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。在540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。继续做2个重复测定。

A 8.2 标准曲线的制定

A 8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液

将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。储备液可分成小量在-20℃下冰冻。使用前，融解并混合均匀。

A 8.2.2 配制标准稀释液

用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：

稀释比例 木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)

1+0 10.0 33.33

1+1 5.0 16.67

1+2 3.33 11.11

1+4 2.0 6.67

A 8.2.3 制备标准曲线

每种标准稀释液做2次重复测定。分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液，50℃水浴保温5min。加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液，在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。每批样品制备一次标准曲线。

A 9 测定结果的计算

木聚糖酶活性(BXU/g) = (木糖浓度*1000*稀释倍数)/(样品重量*反应时间300S)